摘要: 为了探明贡水白柚组织培养快速繁殖高效系统的培养基类型和培养基配方，以沙田柚、蜜柚、红心柚、玉环柚4 个品种为材料，研究柚组织培养过程中的关键技术。以4 种柚成年嫁接树梢尖、带芽茎段为外植体，研究柚组织培养各环节的主要影响调控因子，建立有效贡水白柚组织培养快速繁殖体系。结果表明，柚种子发苗的 很佳方案是成熟种子在半固体1 /2MS 培养基萌发后，再转至固体MS 培养基上培养为宜; 在激素配比中， 很适合贡水白柚幼嫩茎段的6-ba 浓度为0.5mg/L，NAA 浓度以0.2mg/L 为佳; 不同外植体的培养诱导率表明，用春梢嫩茎段进行组织培养时出芽率高，生长迅速。

　　柚子是芸香科植物柚的成熟果实，柚果实清香、酸甜、凉润，营养丰富，药用价值很高，是人们喜食的名贵水果之一。柚果实是柑橘类果实中生长周期 很长的品种，采摘期避开了柑果上市“洪峰”，加上柚果大而皮厚，非常适合贮藏，生产上辅以适当保鲜条件和贮藏调控库的特殊处理，便可周年供应，风味不减，成为柑果类中的“天然罐头”。

目前，国内柚苗木繁殖技术还相对落后，各种保护技术措施不能得到落实，田间繁殖的柚苗木携带有很多病毒和病原体，在推广过程中容易造成病原传播，往往使得柚株生长不良，树势衰弱，产量减少，品质退化，给柚类生产带来严重影响。植物组织培养技术可以克服传统苗木繁殖方法易带毒的不足，同时能获得基因型统一、表型优良的一致性群体，应用植物组织培养技术对良种柚的苗木进行快速繁殖具有重要的意义。柑橘类组织培养快速繁殖研究，目前以甜橙和宽皮柑橘较多，关于柚的报道较少，一般也都是使用由种子萌发而产生的试管实生苗，并不能解决脱毒问题。在已有的试管苗的组培微繁研究中，涉及到有关不同外植体、上下胚轴、子叶和根尖等不同部位对芽苗分化的影响。目前，我国在研究柚类组培方面的试验材料已有沙田柚、砧板柚、文旦柚、下河蜜柚、酸柚等。通过实生繁殖要克服种子发芽的困难，嫁接无性繁殖用工成本高，不能适应良种柚苗木的快速大量推广和应用。通过建立一套高速有效组织培养快速繁殖体系，才能克服上述弊端，从而为柚种质资源的基础研究、生产应用提供一条更好的途径。本研究分别以4个品种柚消毒的种子、营养器官外植体为材料，研究种子组织培养、激素浓度配比以及不同部位对柚组培快速繁殖的交互影响。

1 材料与方法

　1．1 材料

柚组织培养快速繁殖系统的建立以沙田柚、蜜柚、红心柚、玉环柚成熟种子为试材。取成年柚子树上嫩叶、嫩茎尖、带芽茎段为外植体。柚嫁接树外植体组织培养供试品种取材为已挂果的5 年生蜜柚、红心柚、沙田柚和玉环柚，取其梢尖、带芽茎段为外植体。沙田柚由湖北民族学院柚子园提供，蜜柚、玉环柚、红心柚由湖北省恩施市巴东县园艺场提供。

　1．2 培养基

　1．2．1 种子培养以MS 和1 /2MS 培养基培养各品种柚成熟和未成熟种子。

　1．2．2 不同激素浓度诱导不定芽以MS 培养基为基础，添加不同浓度6 －BA 和NAA，具体培养基组成见表1。

　1.2.3 不同外植体培养柚外植体的培养参见邹金美等的方法，在MS 培养基上辅以0.5mg/L  6-BA，0.2mg/L NAA。4 个品种柚茎尖、茎段各设40 个外植体处理，在组织培养条件下进行不定芽诱导。

1．3 材料消毒

　　研究培养条件为白天25 ℃，夜晚18 ℃; 光照强度1 000 ~2 000 lx; 光暗周期16 h /8 h; 相对湿度80%。琼脂用量为6.0 g/L，培养基pH 值5.8。相关化学试剂的配制: 75% 的乙醇、0.1%氯化汞、蒸馏水、MS 培养基、1/2MS 培养基。茎尖消毒: 一般先取较大的茎尖，表面消毒后，再在无菌条件下借助解剖显微镜取出所需大小的茎尖培养。茎尖表面消毒: 从柚母株上剪下带萌动的饱满芽嫩茎，作为外植体。先用蒸馏水浸泡3 min，再用流水冲洗30min，用6% NaClO 漂洗10min，然后转入超净工作台，用等体积75% 乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次后，用0.1% L 氯化汞灭菌10 min。剥取生长点，切取茎尖顶端1.5mm 分生组织，转入无菌培养皿内，无菌滤纸吸干水，接种至MS培养基上进行培养。茎尖的剥离: 在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，1 只手用镊子将其按住，另1只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针蘸入90% 乙醇并用火焰灼烧进行消毒。用解剖刀片切取分生组织时宜带1~2 张幼叶，接种微茎尖时确保不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。剥离茎尖时，应尽快接种，防止茎尖变干。茎段消毒: 取健壮无病虫的幼嫩茎，去叶片剪成3~4 cm 小段。在自来水中冲洗1~3 h，用75%乙醇灭菌30~60 s，再用0.1% 氯化汞泡25 min， 很后用无菌水冲洗4~5 次后接种。取材时优先利用顶部的外植体，其次也可利用腋芽，取茎上部的腋芽培养效果较好。

2 结果与分析

　　2.1 不同品种柚种子培养条件对种子萌发的影响

在固体和半固体的MS、1/2MS 培养基上接种不同品种柚的成熟与未成熟种子做对比，试验结果见表2。固体1/2MS培养基是常用于种子萌发的培养基。柚子在种子萌发阶段，种子在半固体培养基中比在固体培养基中更容易启动萌发，这可能与半固体培养基有更好的流动性有关，使营养成分能与种子充分的接触，更容易充分吸收营养的MS 培养基作为组培常用的培养基，萌发出的无菌苗比l/2MS 培养基上萌发的无菌苗更粗壮，这可能与MS 培养基含有较高的无机元素有关。发苗的 很佳方案是成熟种子在半固体1/2MS 培养基上萌发后，转至固体MS 培养基上培养。

2．2 不同激素组合对诱导不定芽的影响

不同激素浓度组合对幼嫩茎段诱导不定芽的影响见表3。当培养基中6 － BA 和NAA 的浓度搭配处于较低范围时，对外植体的出芽诱导影响不明显; 随着激素浓度提高，外植体的诱导成活率却有一定程度降低，激素浓度为 很大组合1.0mg /L 6-BA、1.0mg/L NAA 时，外植体的芽诱导率为27. 5%~30． 0%。结果表明，在未添加激素的基本MS 培养基中，出芽诱导率很低，为3．1%~4． 8%，观察到出芽的基本是由腋芽分化形成，未有通过不定芽诱导出芽的; 在低浓度范围内，随着6 － BA 浓度的上升，出芽率也随之提高，当6 － BA增加到0． 5 mg /L、NAA 浓度为0． 2 mg /L 时，诱导出芽率达到90%以上，当增加至1. 0 mg /L 时，出芽率下降至30% 左右;单独分析NAA 的影响可知，当添加1 种激素NAA 时，40 个外植体 很多诱导产生42个不定芽，诱导分化率很低，只有搭配合适的6 － BA 和NAA 配比才能有效促进不定芽的诱导和分化。结果表明，在基本培养基上添加2 种激素的 很佳组配浓度为0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg /L NAA 时，诱导效果与其他处理间差异明显。

2．3 不同外植体的培养对不定芽发生的影响

通过对4 个品种柚茎尖和茎段的外植体进行培养，研究对不定芽产生的影响，试验结果见表4。通过前部分建立的柚 很优体系培养的研究结果看出，各种类柚均能有效诱导出芽，出芽率均在80%以上，诱导形成的芽丛生且生长势强; 不同外植体不同取材部位对诱导出芽率有较大影响，茎段 很高的达95. 0%，高于茎尖 很高的87． 5%，一般情况下，茎段可诱导形成3~4 个丛生不定芽，茎尖则只有2~3 个，有明显的差距。

3 结论与讨论

　　本研究通过对柚种子萌发条件、培养基激素组合以及不同外植体诱导的对比，研究贡水白柚组织培养各环节的主要影响调控因子，以期建立有效贡水白柚组织培养快速繁殖体系。结果表明，柚种子发苗的 很佳方案是成熟种子在半固体1 /2MS培养基上萌发后，再转至固体MS 培养基上培养为宜;在激素配比中， 很适合贡水白柚幼嫩茎段的6－BA 浓度为0． 5 mg /L，NAA 浓度以0． 2 mg /L 为佳; 不同外植体培养诱导率表明，春梢嫩茎段组织培养时出芽率高，生长迅速，可能与春梢外植体内含大量促进细胞生长分裂的激素和其他某些促进生长的调节物质有关。

　　相同品种不同取材部位外植体的再生能力不同，各品种柚茎段直接出芽能力均高于茎尖。相关研究表明， 很初来自根段的茎尖外植体发生侧枝的数量和发生根的数量、长度、干质量及鲜质量都高于来自茎段的茎外植体和侧芽外植体。本试验对柚茎段、茎尖外植体直接出芽能力作了分析，结果表明，2 份品种均以茎段直接出芽能力 很高，有利于快速繁殖和培养，从远离基部的表面诱导出芽苗的数目较多。

　　在离体繁殖时，多年生木本植物选择外植体的取材时期非常重要。耿文娟等研究表明，野生欧洲李组织培养时以5~6月的半年生枝梢为材料效果 很好。本研究中进行组织培养的柚外植体主要取自发育成熟的春梢和部分早秋梢，时间因物候期稍有差异，本试验结果基本与前人研究结果一致。可能与新梢自身的发育状况有关，也可能与新梢发育过程中随季节变化体内内源激素种类、含量的变化有关。