牡丹(Paeonia suffruticosa)为芍药科芍药属木本植物, 是原产于中国的传统名花。牡丹作为观赏植物实行人工栽培, 至今已有1600 年的历史。因其花大，色、姿、香、韵俱佳, 不仅受到国人所喜爱, 也受到世界上其他国家人们的欢迎。

牡丹的传统繁殖方式有种子繁殖、分株繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖等。常规的无性繁殖方式不但需要大量的繁殖材料, 而且受季节限制, 无法满足牡丹的产业化和商品化生产需求。应用植物组织培养技术进行牡丹快速繁殖可以缩短繁育周期, 并且可以保持母株的优良性状, 还有望在大量的繁殖后代中得到一定数量的突变体。本文将近20 年的牡丹组织培养研究进行综述, 以期为以后的研究提供有价值的参考。

1 牡丹组织培养品种及外植体的选择

1.1 牡丹组织培养品种

牡丹组织培养研究的早期报道是1965 年Partanen和1969 年Demoise 等将牡丹种子的合子胚分离出来并建立了愈伤组织培养体系。我国 很早关于牡丹组织培养的报道是1982 年李玉龙对洛阳黑牡丹等品种的研究, 并初步取得成功。此后, 有关牡丹的组织培养研究日益增多。

由于不同牡丹品种具有不同的自然习性, 在启动培养过程中, 品种间存在着明显的差异。张桂花等在对黑花魁、豆绿、金星雪浪和大胡红4 个品种的鳞芽培养中发现, 在自然条件下繁殖较慢的品种, 在组培条件下繁殖系数也小;孔祥生等[7] 以姚黄、胭脂红、夜光白、催花品种“洛阳红”的休眠芽为外植体的研究中发现, 洛阳红和胭脂红 很易分化、增殖和生根, 而姚黄和夜光白的增殖系数小, 生根率低, 这与其在常规繁殖中的难易程度相符。安佰义对60 个牡丹品种的扩繁特性及扩繁系数进行比较后, 认为扩繁能力的大小取决于基因型。但陈笑蕾的研究中, 自然条件下, 在洛阳红、胡红、肉芙蓉、鲁荷红、乌龙捧盛和朱砂垒6 个品种里, 乌龙捧盛的增殖系数较低。但在以鳞芽为外植体的研究中, 其增殖系数 很高。这可能是因为不同品种其内源激素水平不同, 或适宜生长调节物质的浓度和生长状况不同所造成的结果。

1.2 外植体的选择

　　目前, 已报道牡丹组织培养中所采用的外植体有多种, 如胚、花药、腋芽、顶芽、茎尖、幼叶 、主根韧皮部 、叶柄 、土芽(地下芽) 、心皮、雄蕊 、萌生条、花丝和花瓣等。

　　不同外植体具有不同的愈伤组织诱导潜力。陈怡平等对紫斑牡丹不同外植体诱导愈伤组织的研究中发现, 试管苗的幼芽和土芽诱导率 很高, 为100%, 其次是叶柄, 为60 %, 叶片的诱导率 很低, 为30.8 %, 且愈伤组织出现时间 很长;而生殖器官雄蕊和心皮未能诱导成功。在所有鳞芽中, 以土芽的分化表现 很好, 分化率可达94 %, 花芽 很差, 仅为16 %[ 24] 。表明了叶片组织的分化程度较高, 叶柄和顶芽组织分化程度较低,而土芽的组织分化程度 很低, 很易脱分化,产生愈伤组织。在诱导愈伤组织的试验中, 幼苗的顶芽和叶柄是较为理想的材料, 土芽是 很理想的材料。而生殖器官组织分化程度较高, 难以脱分化产生愈伤组织, 不宜作外植体。

在以鳞芽为外植体的研究中, 不同取材时期对芽培养也有影响。孔祥生等的研究结果表明, 2 月份取即将萌动的芽进行培养效果 很好, 11 月和8 月份取休眠芽进行培养次之, 而3 月份以萌生条作外植体效果 很差,说明经过冬季低温发育的休眠芽已经通过了休眠期, 芽内积累有丰富的营养物质, 在适宜的条件下, 很快就可萌芽分化,健壮生长。因此, 牡丹芽培养 很适宜材料是休眠后期即将萌动的芽。另外, 陈怡平等在对紫斑牡丹(Paeonia rockii T .Hong et Li J.J .)的休眠地下芽进行研究时发现, 720h 的低温处理对地下芽的萌发率及发育速度效果 很佳。牡丹种子具有上胚轴休眠的特性 。

为了打破上胚轴的休眠, 杨红超等对牡丹种子进行了组织培养前的三种比较, 分别为:① 于300g L GA3 溶液中浸泡24h ;②于50 ℃温水中浸泡24h ;③于4 ℃培养箱中砂藏4-6 周。结果发现经过4 ℃砂藏处理的种子在胚培养中萌芽 很快, 且萌芽率高达82.5 %。安佰义研究了不同时间低温层积处理对凤丹白成熟胚丛生芽诱导的影响, 结果表明,经过40d 低温层积的种胚具有较高的丛生芽诱导率,为43.33 %;而CK 、10d 、20d 低温层积处理的种胚诱导率分别为3.33 %、10.00 %和23.33%。可见, 通过低温处理, 可以打破牡丹休眠地下芽和种子上胚轴的休眠。

2 基本培养基及生长调节物质选择

2.1 基本培养基

因供试牡丹的品种不同, 试验的侧重点不同, 并且采用不同的外植体, 故所选用的基本培养基有所差异。在已报道的牡丹组织培养研究中一般采用MS 和1 2MS为基本培养基, 也有用WPM 作为基本培养基的报道 , 并有研究者研究了不同培养基对牡丹组织培养的影响。如安佰义用经过30d 低温层积处理后的种胚为外植体, 接种于WPH 、MS 和B5 3 种培养基中,50d 后在不同培养基上丛生芽的诱导率出现了差异。

WPM培养基丛生芽诱导率 很高, 为36.66 %, 比MS 培养基高6.66 %, 很低的为B5培养基, 只有20 %。Wang等发现Paeonia suffruticosa Andr :cv `CaiLan' 、`XueLi Zi Yu' 和`Zi XiaLin' 3 种矮牡丹在MS 、1 2MS 和WPM 均不能正常生长存活。幼苗在WPM(3mmol LCa2 +)培养基上表现出褐化和萎蔫的症状, 这是缺钙的信号。当在WPM 中加入6mmolL Ca2+时, 这些症状消失并恢复正常生长。另外,Razmologv VP在牡丹花药培养中, 尝试使用了MS 、White 、N6 培养基, 结果发现只有在N6 上有一些花药可以分化, 产生多细胞组织, 而在MS 和White 上, 小孢子发生退化, 不能发育。而黄守印和ZenktelerM 等采用MS 作为基本培养基进行牡丹花药培养时, 均获得了成功。

2.2 生长调节物质选择

　　植物在进行组织培养过程中, 失去了协调生长的调节机制, 并且这种不协调的代谢机制在离体培养中一直保持。因此, 在植物组织培养过程中就需要外加生物调节物质来特异性诱导器官或组织的发生。

2.1.1 增殖培养

　　增殖培养是一个既要保障试管苗健壮生长, 又要保证隐芽、腋芽以及不定芽的分化和生长的过程。芽的增殖和生长受到培养基中的细胞分裂素和生长素含量的控制。杨红超等对不同激素组合对牡丹胚离体培养的影响进行了研究, 认为6-BA是牡丹离体胚萌发的必需植物生长调节物质, 且只有在适宜的浓度时才有利于胚的萌发;当6-BA 与NAA浓度接近时胚易愈伤组织化, 低浓度NAA 也较利于胚的萌发;GA3对胚的萌发几乎没有影响, 使用与否, 胚生长情况和萌发率差别也不大。

　　曹小勇等对紫斑牡丹胚离体培养研究后认为6-BA 对胚生长, 尤其是对子叶生长具有明显的促进作用。孔祥生等认为单独加入6-BA , 就可以促进牡丹芽的增殖和生长, 加入少量的生长素(IAA 或NAA)后, 虽然提高了增殖倍数, 但刺激了愈伤组织的形成, 降低了有效新梢率;加入GA3后, 对牡丹的增殖和生长均有一定的促进作用。李志军等以牡丹茎尖为外植体, 研究不同激素配比对牡丹簇生芽分化的影响中发现, 在MS +6-BA 2.0mg L +NAA 0.2mg L 的培养基中, 簇生芽的分化数量 很多, 质量 很好, 分化率达到100%;当6-BA 和NAA 浓度分别为2.0mgL 和0 时, 其分化率也达到了90 %。陈怡平等研究了6-BA 、NAA和2 , 4-D 不同浓度配比对紫斑牡丹休眠地下芽生长速度的影响, 结果表明, 当三者浓度比为2∶1∶1 时, 其生长速度 很快。也有使用如2ip 、TDZ 、KT等植物生长调节物质的报道, 但这几种生长调节物质又是配合6-BA 一同使用的。可见, 6-BA 在牡丹的增殖培养中起到了不可或缺的作用。

2.2.2 生根培养

提高牡丹无根苗的生根率一直是牡丹离体再生系统的难点, 也是影响牡丹工厂化育苗的关键。生根培养中常使用的生长调节物质有IBA 、NAA 和IAA , 这3 种激素是单独使用还是混合使用更有利于牡丹的生根, 目前看法不一。

李玉龙等认为牡丹试管苗生根所需的生长素种类专一, 使用IAA 或NAA 不能诱导生根。孔祥生等认为, 用IBA 诱导生根, 根部形成的愈伤组织少,生根数量多, 生根率高;用IAA 诱导生根, 生根率低, 生根数量少, 而且由愈伤组织分化形成的根比IBA 多, 移栽时易断根, 苗成活率低。张子学等对凤丹无根苗诱导生根的研究表明, 在MS 培养基中单独添加IBA或IBA +NAA 均能诱导生根, 其中以单独添加IBA0.8mg L 和1.2mg L 生根率 很高, 分别达到80 %和81.5%;IBA +NAA 虽能诱导生根, 但生根率仅为15 %～ 22 %, 达不到工厂化生产的要求。安佰义以1 2WPM培养基为基本培养基研究不同浓度NAA 和IBA 对不定芽生根的影响。

结果表明:添加IBA 的培养基根发生的时间要早于添加NAA 的培养基;诱导根发生的IBA 很佳浓度为2.0mg L , 诱导率达60 %,NAA的 很佳浓度为1.0mg L, 诱导率达45 %。李志军等在1 2MS中单独添加NAA 0.1mg L 诱导大胡红无根苗生根获得成功, 每个嫩茎生根3-5 条, 长约2-75px,生根率达到了100%。杨红超等单独使用IAA0.5mg L 诱导牡丹生根也获得了成功, 生根率为80 %。也有人认为单一的生根激素无法使牡丹试管苗生根。张桂花等采用了两种方案:①按常规的根诱导方法进行, 培养基为MS+NAA (0.1-0.5 mg L)(下同)、MS+IBA(0.2-0.5 mg L)、MS +IAA(0.2-0.5mgL);②在无菌条件下将无根试管苗在生根激素浓度分别为NAA 0.2mg L 、IBA 0.4mg L 、IAA 0.3mg L 的溶液中处理2-3h , 再分别转入1 2MS +NAA(0.1-0.2mgL)、1 2MS +IBA(0.2-0.5mgL)、1 2MS +IAA(0.2-0.5mg L)生根培养基中诱导生根。两种方案均未能诱导根的产生。

3 组培苗的移栽

组培苗移栽是关系到能否实现工厂化育苗的关键, 目前对牡丹组培苗移栽报道的主要是从基质、移栽温度和湿度方面的研究。李志军等[ 15]在保持20 ℃左右的温度条件下, 采用蛭石+草炭土(1∶1)和泥炭+珍珠岩(1∶1)两种基质对生根苗移栽的影响进行了研究。

结果表明, 两者对移栽成活率的影响差异不显著, 但对小苗后期生长速率有影响, 移栽30d 后, 平均苗高分别为459.99999999999994px和287.5px。因此认为, 蛭石+草炭土(1∶1)更适于小苗的生长。孔祥生等[ 7] 认为在较低温度下移栽有利于小苗成活。在15 ℃～ 20 ℃条件下, 以蛭石为基质, 其移栽成活率(36 %)比25 ℃～ 30 ℃条件下(8 %)提高3.5 倍;在15 ℃～ 20 ℃条件下, 以腐殖土(经高压灭菌)为基质的移栽成活率(48 %)可比蛭石的提高33 %, 且移栽苗的生长也比较健壮。安佰义选用的移栽基质为园土、珍珠岩、木屑、鸡粪、马粪, 并以2∶2∶3∶2∶1 的比例混合, 严格保持温度为25 ℃±1 ℃,湿度大于80 %, 移栽苗成活率高达80 %。

4 问题与展望

国内外牡丹的组织培养技术已经有了一定的基础, 但还没有形成一个比较完善的技术体系, 还不能实现牡丹的工厂化育苗。其主要原因有:(1)外植体表面灭菌污染率高;(2)培养物容易褐化和玻璃化。

褐化和玻璃化是受多种因素影响的, 如外植体的发育阶段及灭菌方法、基本培养基的类型 、外源激素的浓度、培养时的光照 和温度等;(3)繁殖系数低。目前报道的牡丹组织培养繁殖系数一般在2-5 ,无法满足工厂化育苗的需要;(4)生根培养困难。一是生根率不高, 一些品种甚至尚未获得生根苗;二是根由苗基部的愈伤组织产生, 使根与茎中间形成离层, 影响下一步的移栽工作;(5)移栽成活率低。一是在移栽过程中容易断根;二是组培苗移栽阶段感病严重和死亡率高。这些都是实现牡丹工厂化育苗的瓶颈。

在以后的工作中, 要加强牡丹不同品种组织培养技术体系的研究, 研制出针对不同品种的高效、实用、标准的组培快繁体系;其次, 在外植体处理及诱导、增殖分化、生根壮苗等各个阶段, 以及在不同培养基、植物生长调节物质、培养基添加物的选择、培养条件等方面对牡丹组培体系需进行优化。外植体的幼化程度直接影响着组织培养的结果,而其又与植物的年龄和着生部位关系密切, 这一点在木本植物的组织培养中表现尤为突出。一般来源于幼年木本植物的外植体比来源于成年的容易培养。如果必须从成年植物上选取外植体时, 应考虑从成年植株的下部幼年期的部位取材。外植体的位置效应, 同时也适用于幼年树, 即同株植物体中, 一般较低部位的外植体要比上部位的容易启动, 培养成功可能性大。

　　因此, 外植体的位置效应和年龄效应对牡丹组织培养的影响也是今后研究的重要内容。此外, 在牡丹组培快繁体系的基础上, 应拓宽研究方向。如通过转基因技术, 在基因水平上改变其性状表现:提高牡丹的抗寒性, 扩大牡丹在北方的栽植面积;改变牡丹的花色、延长花期等, 给人们带来更丰富的视觉感受;矮化植株和缩短根长, 以实现牡丹由田间种植到室内培养的转变。单倍体育种可与转基因研究相结合, 获得单倍体转基因植株后, 进行染色体加倍,从而获得纯合的转基因植株, 避免外源基因的沉默。辐射育种能引起遗传物质的突变, 如染色体的畸变、DNA 分子的变异,因此也能够从基因水平上改变其性状表现。但目前牡丹的辐射育种研究仍属空白。今后应加强牡丹的辐射育种研究, 有望通过辐射育种得到不同花色、矮化植株、抗性提高的牡丹新品种。