铁皮石斛( Dendrobiumcandidum) 是一种珍稀名贵的药用和观赏植物，是我国重点保护的濒危珍稀物种，由于其对生长条件要求比较苛刻，且在自然界中多与真菌共生，因此人工栽培成活率较低、生长缓慢。内生真菌( fungal endophytes) 是能够定殖在植物组织内但不引起病害症状的真菌，它们与宿主互惠共生，赋予植物优良生长性状。研究发现，内生真菌对十字花科、禾本科、菊科、茄科和包括铁皮石斛在内的兰科等不同植物都表现出了较好的促生作用，说明内生真菌具有较为广泛的分布。目前，关于铁皮石斛促生研究的内生真菌大多来源于铁皮石斛，很少来自其他宿主植物。内生真菌在自然界具有广泛的宿主范围，由此我们推测其他植物同样蕴藏着可能对铁皮石斛具良好促生功能的内生真菌。为了发掘更多优良的对铁皮石斛有促生作用的内生真菌，笔者拟拓宽宿主植物的分离范围，从山茶科、杜鹃花科等非兰科植物中分离内生真菌，筛选铁皮石斛优良促生菌株，并结合菌株的形态学和分子生物学特征对其进行分类学鉴定，以期为内生真菌在铁皮石斛生产上的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1． 1 材料

　　山茶( Camellia japonica)、柃木( Eurya japonica)、大果杜鹃( Ｒhododendron) 、大叶杜鹃( Ｒhododendronmucronatum G． Don． ) 、小叶杜鹃( ＲhododendronobtusumPanch． ) 、柑橘( Citrus reticulate) 、八角( Illicium anisatum L． ) 和毛樱花( Prunus jamasakura)8 种木本植物的茎和叶采自日本茨城大学农学院校园。铁皮石斛( Dendrobium candidum) 组培苗为广西农业科学院生物技术研究所提供的桂斛1号。

1． 2 菌株分离

　　将新鲜健康的植物的茎和叶分别用流水冲洗表面的尘土，自然晾干，剪切成约0.5 cm× 0.5 cm 大小的片段，每种组织样随机取15 个片段用75% 乙醇浸泡15-60s，1 % 次氯酸钠浸泡1-3 min，无菌水冲洗3 次以上，平放于玉米粉培养基平板上( 玉米粉琼脂25 g /L; 琼脂粉15 g /L; 氨苄青霉素50μg /L; 链霉素50 μg /L) ，置26 ℃培养箱培养。采用菌丝尖端挑取法，根据菌落形态、颜色、生长时间的不同，及时挑取组织块下或周缘生长的菌丝转接于麦芽汁培养基平板上。

1． 3 内生真菌的筛选

　　为了排除致病性菌株和腐生菌株，参照Narisawa等的方法根据菌落形态、产孢结构将分离菌株进行分组，每组随机取1 株代表菌株，接种于燕麦培养基平板上，每皿3 个菌块，培养7-14 d 后备用。白菜种子经表面消毒、催芽2 d 后移栽至培养好的菌落上，于光照培养箱中共培养。以未接种菌株为对照处理，每个处理重复4 次。14 d 后观察白菜苗的生长情况，将白菜根部洗净后放入50 ℃烘箱中烘烤3 d 称量干质量。

1． 4 菌株的分类鉴定

　　1) 菌株形态学观察。将从冰箱取出的菌种接种至马铃薯葡萄糖培养基( PDA) 上，培养3 周后观察菌落形态特征。用插片法将纯化的菌株接于燕麦培养基， 25 ℃培养2 ～4 周，待明显看到菌丝着生在盖玻片上时，将玻片取出，于光学显微镜下进行观察。

　　2) 菌株的分子鉴定。采用TaKaＲa MightyAmpDNA Polymerase Ver． 2 试剂盒，挑取麦芽汁平板上的菌丝作为模板直接用于PCＲ 反应。采用White等通用引物ITS1/ITS4、NS1 / NS4 两对引物分别扩增菌株的ITS 和18S rDNA 区域。PCＲ 反应体系为: MightyAmp DNA Polymerase ( Ver． 2) 0． 5 μL，buffer 25 μL， 20 μmol /L 正反引物各1 μL，模板DNA1 μL( 挑取少量菌丝) ，用ddH2O定容至50 μL。PCＲ反应条件参数参照试剂盒说明。引物合成和测序均由华大基因科技有限公司完成，测序后登录Gen-Bank 进行比对，采用MEGA 5． 0软件构建NJ 系统发育树。

1． 5 菌株与铁皮石斛组培苗的共培养

　　将供试菌株每皿接种3 个菌块于燕麦培养基平板上，培养7-14 d 后备用。选择长势一致的铁皮石斛组培苗移栽至菌落上，每个菌落移栽1 株苗，于光照培养箱中共培养。以未接种菌株为对照处理，每个处理重复4 次。60 d 后测量株高等生长指标，并采用Narisawa 等的表面消毒法对根部内生真菌进行再分离; 另外进行根部石蜡切片和棉兰染色在光学显微镜下观察。

1． 6 菌株与铁皮石斛盆栽苗的共培养

　　选取长势一致的铁皮石斛组培苗，移栽至培养基质为树皮和木屑( 体积比3∶ 1) 的塑料育苗盘中( 规格为50 cm× 50 cm × 6 cm) ，每丛种植3 株苗，每盘种植9 丛，成活后浇菌液。将菌丝块接种于PDB 培养基中于摇床振荡培养( 26 ℃，转速为150r /min) ，培养14 d 后收集菌丝团，打碎后配制浓度为5 × 105 cfu /mL 的菌液。菌液30 mL /丛，每隔15 d浇菌液1 次，共浇菌液3 次，以未浇菌液为对照处理，设4 个重复。接种后6 个月调查生长指标。

1． 7 统计分析

　　采用Excel 2003 和DPS 6． 55 软件进行分析，试验数据以平均值± 标准误表示。

2 结果与分析

2． 1 菌株的分离

　　从8 种木本植物的茎和叶共计240 个组织块分离获得了204 株真菌，其中分离自山茶、柃木、大果杜鹃、大叶杜鹃、小叶杜鹃、柑橘、八角和毛樱花的真菌分别为25、16、36、31、36、14、31 和15 株，分离自叶部和茎部的菌株分别占42． 7% 和57． 3%。分离菌株大多数约4 d 在分离培养基上长出，多数为拟盘多毛孢属Pestalotiopsis( 72． 8%) ，其次为炭疽菌属Colletotrichum ( 12． 1%) 和拟茎点霉属Phomopsis( 8．9%) 。

2． 2 内生真菌的筛选

　　为了排除病原菌和腐生菌，将分离菌株分成菌落形态差异明显的11 个组，每组随机取1 个代表菌株接种白菜无菌苗。其中5 个代表菌株分离自叶部，6个代表菌株分离自茎部。接种结果表明11 个代表菌株中只有1 个菌株24L-4(9%) 对白菜没有表现出致病性，其余的10 个供试菌株(91%) 接种白菜后出现了不同程度的叶片黄化、植株矮小甚至萎蔫，生物量显著低于对照处理( 图1) 。菌株24L-4所在组只有24L-41 个菌株，该菌株接种白菜后生物量为( 60． 2 ± 5． 6) mg，较对照处理( 52． 2 ± 4． 2)mg 提高了15． 3% ( 图1) ; 可见，菌株24L-4对白菜的生长不但没有表现出负面影响，反而表现出了促生作用。

2． 3 促生菌株的形态学鉴定

　　菌株24L-4 分离自山茶叶部( 图2A) 。该菌株在PDA 培养基上生长缓慢，在25 ℃下培养2 周后菌落直径接近15 mm，菌落接近圆形，鼠灰色，中间绒毛状，边缘圆滑、质地致密( 图2B) 。在燕麦培养基上培养1 个月后产生分生孢子，菌丝分支有隔，浅褐色，光滑，1～ 4 μm( 平均2 μm) 宽; 分生孢子梗沿着菌丝的蔓延直立产生，偶有弯曲，无分支，褐色，光滑，厚壁，13-275 ( 平均70) μm × 2-4 ( 平均3)μm，1-16 个横隔; 产孢细胞位于产孢梗末端，褐色，近圆柱形，光滑，偶有分隔，4-28 ( 平均12)μm × 2 ～4( 平均3) μm; 分生孢子链状，褐色，光滑，近圆柱形、纺锤形或椭圆形，0-1个分隔，4-7( 平均5) μm × 2-4( 平均3) μm( 图2C-E) 。上述特征与Devriesia lagerstroemiae 的形态特征基本相符。

2． 4 序列登录号及系统发育分析

　　菌株24L-4 的rDNA-ITS 区域PCＲ 扩增获得1条568 bp 长的序列，GenBank 登录号为KP197670，在GenBank 中通过Blast 程序进行核苷酸序列比对，结果表明该菌株序列和Devriesialagerstroem( GU214634) 的同源性高达99%。基于该比对结果建立的系统进化树如图3 所示，菌株24L-4 以高达95%的支持率与Devriesia lagerstroem 单独聚为一支。此外，采用NS1 和NS4 为引物扩增出1 条1073 bp 的序列，GenBank 登录号为KP197671，Gen-Bank 的核苷酸BLAST 比对结果表明，菌株24L-4 的18S rDNA 序列和Devriesia lagerstroem( JN938704)序列同源性高达100%。通过以上对菌株24L-4 的形态学、核糖体DNA的ITS、18S 的序列的比对分析，将该菌株确定为Devriesia lagerstroem。

2． 5 菌株24L-4对铁皮石斛组培苗生长的影响

　　菌株24L-4 接种铁皮石斛组培苗60 d 后，长势明显优于无接种对照植株，各生长指标的测量结果见表1。菌株24L-4处理的各个生长指标均高于无接种的对照处理，其中叶宽、茎径、株高和干质量值分别较对照增长65． 7%、27． 3%、33． 3%和45． 1%，与对照相比差异显著。经表面消毒再分离，菌株24L-4 在根、茎、叶部组织块的分离频率分别为53． 3%、20． 0% 和0． 0%，结果表明在组织培养条件下，该菌株能够定殖于铁皮石斛苗的根部和茎部，根部的分布频率较茎部高，在叶部没有分布。在光学显微镜下观察，除了在维管柱没有观察到菌株的定殖结构外，在根部的纵切面观察到深色有隔菌丝和类似微菌核的定殖结构于细胞内，横切面的皮层中同样观察到这些定殖结构的分布，说明该菌株24L-4不能定殖于铁皮石斛根部的维管柱，可定殖于外皮层和皮层。

2． 6 菌株24L-4对铁皮石斛盆栽苗生长的影响

　　菌株24L-4 接种铁皮石斛盆栽苗6 个月后各生长指标的测量结果见表2，菌株24L-4处理的各个生长指标均高于无接种的对照处理，其中鲜质量、茎径和干质量与对照的差异达到了显著水平，分别较对照增长了83． 9%、104． 0%和114． 7%。

3 讨论

　　本研究尝试从一些非兰科植物中分离筛选对铁皮石斛具促生作用的内生真菌，并成功获得了1 株目标菌株24L-4。该菌株分离自茶科植物，接种十字花科的白菜、兰科的铁皮石斛都表现出了较明显的促生作用，再次证明了内生真菌的宿主范围和应用的广泛性，也说明了在发掘内生真菌资源时可以考虑拓宽宿主植物的分离范围。

　　经菌落和孢子形态、ITS-rDNA 和18S-rDNA 序列分析，发现菌株24L-4 与Devriesia lagerstroem 为同一个种。Devriesia( 德福里斯孢) 建立于2004 年，该属是第2 个已发表的耐热的枝孢类似属，建属时包含5 个种( D． acadiensis、D． shelburniensis、D．chlamydospora、D．staurophora 和D． thermodurans)。目前，根据Index Fungorum 数据库的 很新结果，该属名下已报道26 种。该属的多数种菌株分离自土壤和耐热环境，D． acadiensis、D． staurophora、D．thermodurans 产生的厚垣孢子在75 ℃高温下暴露30 min 仍能萌发; 少数种报道分离自植物，如D．lagerstroem 分离自紫薇( Lagerstroemiaindica) ，D． xanthorrhoeae 分离自黑仔树( Xanthorrhoeaaustralis) ; 可见该属的生态分布比较广泛。

　　D． lagerstroem 于2009 年作为一个新种报道，分离自紫薇，无厚垣孢子，无耐热功能; 菌株24L-4同样分离自植物( 山茶花) ，也没有观察到厚垣孢子的产生。这是D． lagerstroem作为一种植物促生内生真菌的 报道。

　　根据本文的研究结果，24L-4 在燕麦培养基和树皮-木屑栽培介质中对铁皮石斛的组培苗均表现出了良好的促生效果。接种组培苗60 d 后茎径、干质量较对照的增幅分别为27． 3%和45． 1%，而接种盆栽苗6 个月后茎径、干质量的增幅分别达到了104． 0%和114． 7%，可见该菌株在盆栽条件下表现出更为明显的促生作用。菌株再分离和根部定殖切片显微观察结果表明，菌株24L-4能成功定殖于铁皮石斛苗根部的皮层和外皮层，但并没有对植株的生长造成负面影响，反而促进其生长，说明该菌株与铁皮石斛苗之间建立了一种共生关系，具体的共生机制仍需进一步探索。

　　综上，本文从山茶中分离筛选获得1 株对铁皮石斛具较好促生作用的内生真菌24L-4，结合形态学特征、ITS-rDNA 和18S-rDNA 序列分析将其鉴定为D． lagerstroem。D． lagerstroem 于2009 年被 报道，本文则报道了D． lagerstroem 具有良好的促生功能。该菌株对铁皮石斛组培苗表现出显著的促生作用，可用于铁皮石斛专用菌肥的开发利用。