丽格海棠( Begonia elalior) 为秋海棠科秋海棠属多年生草本花卉，为球根海棠和野生秋海棠杂交选育而成。其花期长、花朵大、花色丰富、鲜艳，深受消费者的欢迎，多用于家庭几案、桌饰、窗饰、宾馆大堂、客厅、餐厅和会议室摆放，是冬春季节美化室内环境的重要花卉。丽格海棠通常无种子，一般采用扦插、组织培养进行繁殖。扦插繁殖主要以茎插和叶插为主，但繁殖速度慢，且非常容易烂根，很难满足市场需求。笔者采用丽格海棠不同部位，对其进行丛生芽诱导、继代增殖和生根培养比较研究，以建立一套完整的组织培养体系。

1 材料与方法

　　1.1试验材料供试材料为盆栽丽格海棠。

　　1.2试验方法

　　1.2.1培养基的配制。

采用MS 培养基，pH 5.8，在121~126 ℃灭菌15－20 min。蔗糖30 g /L，卡拉胶9.0 g /L。

诱导培养基: MS + 6-BA1.0mg/L + NAA0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 1.5mg/L +NAA 0.1mg/L; MS+ 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L; MS + 6-BA 1.0mg/L + 2，4-D 0.2mg /L; MS + 6-PA 1.0mg /L + NAA 0.2mg/L; MS + 6-BA1.5mg/L + NAA 0.2mg/L; MS + 6-BA 1.5mg/L + NAA 0.2mg /L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg /L; MS + 6-BA 1.5mg/L + 2-4，D 0.1mg/L; MS + 6-BA 0.5mg /L + NAA 0.8mg/L; MS + 6-BA 1.5mg/L + 2-4，D 0.1mg /L + NAA 0.1mg/L; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.6mg /L; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L; MS + 6-BA 0.5mg /L + NAA 0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 0.3mg/L+ NAA 0.4mg/L; MS + 6-BA 0.8mg/L + NAA 0.4mg/L + 腺嘌呤8mg/L; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L + 2，4-D0.1mg/L; MS + 6-BA 0.5mg/L + 2，4-D 0.1mg/L。

继代培养基: MS + 6-BA 1.0mg/L +IBA 0.2mg/L; MS+6-BA 1.0mg/L + IBA 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L。

壮苗培养基: 以继代配方为基础，大量元素减半，糖类减半，不添加激素。

生根培养基: 1 /2MS + IBA 0.1mg/L +NAA 0.1mg/L;1/2MS + NAA 0.3mg/L; 1 /2MS + NAA 0.6mg/L; 3 /4MS +IBA 0.3mg/L + KT 0.15mg/L。

1.2.2培养条件。温度22－26 ℃，光照强度1 200－1 500lx，光照周期12－14 h /d。

　　1.2.3外植体的消毒及处理　取丽格海棠的成熟和幼嫩叶片、叶柄、茎段，将外植体放置于密封培养瓶中，在4 ℃的冰箱中冷藏12－24 h 备用，将处理后的材料中放于少量洗衣液(0.5%) 的水中浸泡并摇匀， 30 s 后把浸泡液倒掉，放于流水下冲洗10 min。在超净工作台上先用2%次氯酸钠浸泡摇匀8~10 min( 叶片8 min; 其余外植体10min) ， 很后用无菌水冲洗4 次，每次3min 左右。再用0.1%升汞浸泡摇匀消毒8~10 min，将消毒好的外植体置于经过高温灭菌后的无菌水空瓶中并盖好盖子，接种时先用消毒后的镊子夹出放在经高温灭菌的牛皮纸上，然后用消毒过的解剖刀或刀片对外植体进行切割，叶片切成1 cm2 左右大小，叶柄、茎段切成1 cm左右，接种于培养基上。

外植体培养30 和60 d 后分别统计死亡率和分化率。污染率= 污染数/接种总数× 100%。死亡率= 死亡外植体数/有效外植体总数( 即接种数－ 污染数) × 100%。分化率= 分化外植体数/有效外植体总数× 100%。

1.2.4不同外植体分化情况比较。选取丽格海棠的叶片、叶柄、茎段( 有叶腋生长点) 为外植体，观察统计污染率、死亡率和分化率。

1.2.5继代培养。取诱导分化出的丛生芽，接种到培养基上，每瓶接种3－4 团丛生芽，然后放入培养室中培养， 30 d后观察其继代生长情况。

　　1.2.6壮苗培养。将符合壮苗的小型继代苗植株，按无菌操作要求接种到壮苗配方培养基上，每瓶3－5 个小植株苗，然后放入培养室中培养， 30 d 后观察其生长情况。

　　1.2.7生根培养。选择生长健壮且高3－5 cm的增殖苗，将其分成单苗接入生根培养基中进行生根培养， 30 d 后调查其生根率和根系生长状况。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对外植体愈伤组织形成与分化的影响　由表1可知，综合考虑叶片培养污染率、60 d 死亡率和60 d 分化率，叶片适宜培养基为MS +6-BA 1.0mg/L + NAA 0.2mg/L +腺嘌呤8mg/L，虽然其分化率只有34.8%，但由于污染率低，总体表现 很好; 叶柄适宜培养基为MS +6-BA 0.5mg/L +NAA0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L，此培养条件下污染率为20.0%， 60d 死亡率和60d 分化率分别达到33.3%和66.7%; 茎段适宜培养基为MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L + 2，4-D 0.1mg /L。一般30 d 分化率高的60d 分化率也较高，但叶柄培养基MS +6-BA 0.5mg/L + NAA0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L， 30d分化率只有8.3%，而60 d 分化率却达到66.7%。综合来看，适宜叶片分化的激素配比为MS + 6-BA 1.0mg/L + NAA 0.2mg /L + 腺嘌呤8mg/L，适宜叶柄分化的激素配比为MS +6-BA0.5mg/L + NAA 0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L，适宜茎段分化的激素配比为MS +6-BA 0.5mg/L + NAA 0.4mg/L +2， 4-D 0.1mg /L。

　　同时，由于叶片在培养过程中，污染率相对较低，整体分化率相对较高更适宜应用于离体培养。

　　叶片诱导形成愈伤组织的情况见图1，茎段和叶柄诱导产生芽和愈伤组织的情况见图2。

　　2.2继代培养　将诱导培养的芽苗切割后转入增殖培养基中，培养30 d 后的增殖结果表明，MS + 6-BA 1.0mg/L + IBA0.2mg/L 培养基30 d 后新的丛芽长高长大，叶子膨胀，苗茎长高变粗，形成小植株，生长状况旺盛( 图3a) 。虽然MS+ 6-BA 1.0mg/L + IBA 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L 培养基也有部分开始长出新的丛芽，但丛芽不明显，局部发黄，呈玻璃化现象( 图3b) ，因此，在后期的壮苗培养过程中，以此培养基作为壮苗培养的基础培养基。

　　2.3 壮苗培养　30 d 后壮苗结果( 图3c) 表明，经过壮苗，植株明显变得更加粗壮，为生根培养奠定基础。

2.4 生根培养　由表2可知，不同培养基都可以诱导生根，NAA 浓度过高时，根较细长，降低NAA 浓度，添加6-BA 时，根系生长茂密、粗壮，因此，诱导丽格海棠瓶苗生根较为理想的培养基为1/2MS +6-BA 0.1mg/L + NAA 0.1mg/L( 图3d、e、f) 。

3 结论与讨论

　　在组织培养中，生长素能引起完整组织中细胞扩展，其生理作用是促进细胞和器官的伸长和细胞分裂，4℃的低温预处理有利于叶片、叶柄和茎段外植体的诱导培养。不同外植体其分化途径不同，叶片和叶柄经愈伤组织诱导成芽，茎段则可直接进行芽的诱导，虽然缩短了培养时间，但愈伤组织诱导的丛生芽较多。如将茎段和叶柄进行4 ℃下冷藏48h 前处理，茎段和叶柄在初代培养中液体溢出量少，污染率和死亡率低，且分化出芽所需时间短，可能因为低温处理时，一方面低温可能在一定程度上抑制微生物的生长，另一方面，在冷藏阶段，茎或叶柄切段的分泌物己有部分外渗，因而培养阶段分泌物量减少，对外植体的浸泡及毒害作用也就减轻，从而降低了初代培养的死亡率和污染率，大大提高了组培效率。

　　初代培养的目的是建立无菌的植物组织培养离体生长体系，因此其成功与否是组织培养能否进行的关键环节。由于受植物遗传特性、生理生态特性及外界环境条件等的影响，不同植物启动其离体器官或组织脱分化，进而再分化建立组织培养无性系所需的条件不同。全能性是任何植物活细胞都具有的一个特性，但在一个物种中可能并非所有的品种，在一个属中也可能并非所有的种都能同样地表达这个特性。在由同一个植株切取的外植体中，全能性的表达与否还可能因外植体的生理状态而不同。在快速繁殖中，重要的是选择 很佳状态的组织或器官，且这些组织或器官能够尽快诱导形态发生，这是实现快速繁殖的关键。秋海棠属植物组织培养中，叶片、叶柄、花梗、花瓣以及嫩茎均可作为离体培养对象，但 很常用的外植体类型是叶片和叶柄，因为叶片和叶柄资源丰富，取材容易。四季秋海棠、铁十字秋海棠、莲叶秋海棠、突脉秋海棠均有以叶片作为外植体进行离体培养的报道; 蟆叶秋海棠及其杂种的组织培养中，绝大多数以叶柄作为外植体，其次是叶片；而球根秋海棠和丽格海棠杂种群，多以叶片作为外植体实现植株再生，其次是叶柄。钟十传等研究表明，秋海棠属植物中的球根秋海棠“金正日花”组织培养中嫩叶是适宜的外植体类型。陈琼珍等在铁十字秋海棠组培快速繁殖研究中，采用卷成漏斗状尚未展开的嫩叶作为离体培养的外植体，启动培养效果好。但该试验中，中度成熟器官无论从成活率还是分化率上均优于幼嫩器官，因为后者在表面消毒过程中极易死亡，从而初代培养成功率很低。秋海棠属植物组织培养中以茎段作为外植体的报道较少，可能是茎段含水量较高不易成活。

　　该研究对叶、叶柄和茎段外植体的死亡情况和分化情况进行比较表明，经愈伤组织诱导途径的诱导系数远大于直接芽诱导途径，但愈伤组织诱导途径诱导时间较长，一般为20-60 d，芽诱导途径较快， 20 d 左右分化。茎段作为外植体进行离体培养时，可不经过愈伤组织阶段直接诱导出芽，其分化出芽所需时间短，约20 d 即开始分化，芽色嫩绿; 而叶片、叶柄和茎段诱导形成愈伤组织的时间约50 d，虽然反应时间慢，但产生的愈伤组织团多，诱导丛生芽的数量也多，生长状况更加良好。

　　该试验通过对丽格海棠叶片、叶柄和茎段离体培养技术的研究，建立了一套较完善的组培快繁体系。MS + 6-BA 1.0mg /L + 2，4-D 0.2mg/L + 腺嘌呤8mg/L是诱导叶片愈伤组织培养的 很佳激素配比; MS + 6-BA 0.5mg/L + NAA 0.2mg /L + 腺嘌呤8mg/L 是诱导叶柄和愈伤组织培养的 很佳激素配比，2，4-D 在丽格海棠组织培养过程中，能够很好地促进愈伤组织的形成; MS + 6-BA 0.5mg/L +NAA 0.4mg/L + 2，4-D0.1mg/L 是诱导茎段愈伤组织的 很佳激素配比; MS + 6-BA 1.0mg/L + IBA 0.2mg/L 是继代培养的 很佳激素配比，1 /2MS + IBA 0.1mg/L +NAA 0.1mg/L 是生根培养的 很佳激素配比。该研究为丽格海棠工业化生产提供一定的理论依据。